實驗室

植物生理暨分子生物實驗室（R2707）

指導教授：黃麗芬老師

研究專長

1.改良水稻細胞表現醫療用蛋白系統

2. 植物組織培養:天山雪蓮

實驗室近期執行計畫簡介：

110科技部專題研究計畫:應用CRISPR-Cas9系統編輯水稻基因以優化重組蛋白表現量

近來，植物細胞生產人類葡萄糖腦苷脂酶重組蛋白，經美國食品藥物管理局核准治療遺傳性疾病高雪氏症，證實植物細胞具有高生物安全性及生產成本低的優勢可用於生產高醫藥活性外源蛋白。植物細胞重組蛋白質生產系統中，低過敏原的水稻細胞，在生產重組蛋白的產量上表現亮眼，本實驗室長期聚焦在研究水稻懸浮細胞外源蛋白表現系統，雖已經藉由培養液的優化、建立更好的培養政策、提供高效率的分泌訊號、降低轉錄負調控因子干擾等，成功提升重組蛋白的產量，然而，我們也發現水稻染色體內生αAmy3啟動子轉錄活性遠比目前水稻懸浮細胞中強度最佳的1.1 kb大小的αAmy3啟動子高出許多，因此應用染色體內生αAmy3啟動子生產重組蛋白，將可再提升重組蛋白的產量，讓此系統朝商業化重組蛋白量產等級提升。本實驗室已建立水稻CRISPR/Cas9 基因敲入技術，成功的以染色體內生αAmy3啟動子與分泌性胜肽鏈表現GFP重組蛋白並分泌至培養基中。基於此，本計畫將利用CRISPR/Cas9 knock-in技術，將高價位醫藥用蛋白基因-人類骨型態蛋白BMP2直接鑲嵌在內生αAmy3啟動子與訊號胜肽之後，藉由內生αAmy3啟動子在缺糖培養時所表現的高活性，預期將增大BMP2的產量。此高表現量的水稻細胞外源蛋白表現平台將可繼續應用於各式高價值醫藥用蛋白基因的外源表現與生產。此外，此CRISPR/Cas9 knock-in的技術建立，將擴展應用在敲入其他對水稻生長、生理或對抗生物與非生物逆境基因有用基因，能有助於了解水稻生理機制及提高水稻在逆境的應變能力。

106-109科技部專題研究計畫:水稻細胞表現人類幹細胞轉錄因子Oct4重組蛋白的研發與應用

利用植物懸浮細胞生產醫療用的重組蛋白，具高度生物安全性，生長快速，且可進入生物反應器系統進行大規模化量產，因此近年各國積極開發植物細胞生產外源蛋白。人類Oct4蛋白是維持多能性的胚胎幹細胞最不可缺少的因素之一，目前利用重組蛋白技術，讓Oct4 以重編程因子的角色，誘導體細胞成為誘導性多功能幹細胞，成為幹細胞在再生醫學應用的關鍵技術。在國內發展良好的水稻懸浮細胞αAmy3 啟動子重組蛋白生產系統已被視為具高效率生產外源蛋白之潛力系統，然而，尚未用來表現這一類不穩定的人類轉錄因子重組蛋白。我們先前利用水稻懸浮細胞生產Oct4 時，在水稻細胞內雖可完整偵測Oct4 重組蛋白，但當這個蛋白分泌至水稻細胞外時，卻被切成約兩個約16 及28 kDa 的蛋白片段。欲以分泌目標蛋白的方式，簡化蛋白純化過程並提升重組蛋白產量，研究水稻分泌性蛋白酶是這植物重組蛋白表現系統商業化的關鍵基礎。本計畫藉由水稻懸浮細胞生產Oct4 人類轉錄因子重組蛋白，建立Oct4 活性分析系統，再藉由添加蛋白酶抑制劑策略，增加產量。藉由研究水稻懸浮細胞分泌性蛋白酶，進一步建立專一蛋白酶缺失的水稻突變株，提供低蛋白酶水稻懸浮細胞株體系，以專一生產Oct4 這一類易分解的高價值外源蛋白。